Podobnie jak wcześniejsze tytuły Mario Tennis, Mario Tennis Open zawiera postacie, ustawienia i scenariusze z serii Mario. Gracze mogą brać udział w standardowych meczach tenisa, ale także grać w specjalne warianty o różnych zasadach i celach. Dostępne są dwadzieścia cztery różne grywalne postacie, każda ze specjalnymi cechami, które są wykorzystywane na korzyść graczy. Mario Tennis Open to także pierwsza gra Mario Tennis z jednoczesną grą online.